利用鈣成像技術記錄大腦活動，隨著功能光學成像技術的發展，神經學家們已經可以研究腦區和神經元內部的工作情況。功能鈣成像技術就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細胞內游離鈣離子濃度，以此細胞的功能狀態。目前它被廣泛應用于實時監測一群相關神經元內鈣離子的變化，從而判斷其功能活動。該技術的出現使得科學家可以親眼目睹神經信號在神經網絡之中時間和空間上的傳遞穿梭。雙光子顯微鏡有這么多優點，那么雙光子顯微鏡有哪些應用呢？美國激光熒光雙光子顯微鏡光損傷

和很多偉大的科學發明一樣，雙光子顯微鏡的出現也有一點偶然，但正是那瞬間的靈感為生物科學尤其是神經科學帶來了一種**性的成像技術：雙光子激發熒光顯微鏡。1990年初，當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業準備前往瑞士讀博后時，他看了一本關于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學效應——強光和物質的相互作用。當時，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個紫外光子激發標記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數據則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。國內雙光子顯微鏡成像視野是多少雙光子顯微鏡是結合了雙光子技術和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。

在該自適應光學雙光子熒光顯微鏡中，她們將空間光位相調制器光學共軛到顯微物鏡的后焦平面，通過位相調制器將入射光分成若干子區域，每一塊子區域的波前都可以被控制。同時，她們用數字微陣列光處理器，以不同的頻率同時調制其中一半子區域的入射光強度，以另一半子區域作為“參考波前”。來自所有子區域光束會在焦點處會聚干涉，通過監測焦點激發的雙光子信號隨時間的變化情況，并進行傅里葉變換分析，可以“分解”得到被調制的每一塊子區域的“光線”的貢獻信息，從而可以實現對一半子區域波前的并行測量。對另一半子區域重復這一測量過程，從而獲得整個入射波前的信息并進行校正。該方法耗時很短，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正，無需復雜的計算，適用于任何標記密度和標記類型的樣品。更重要的是，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內的成像質量。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區域的生物、醫學問題提供了可行性方案。

雙光子顯微鏡的優勢相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優勢呢？它能做到什么普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性。除此之外，因為只有物鏡焦點處能發生雙光子激發效應，所以掃描的精確度極高，也能提高激發光效率，減少被掃描點之外的熒光物質消耗。雙光子顯微鏡在各領域研究中已有許多成功實例。

像差問題一直困擾著光學領域的工作者。像差會使光波前發生形變，不僅降低成像的信噪比和分辨率，使得很多時候我們只能“霧里看花”，更甚者，產生贗像，或無法獲得有意義的圖像。像差問題對雙光子成像的影響尤為嚴重，因為在那里，熒光信號對入射光強度的依賴是平方關系，一旦入射光波前形變，不僅聚焦強度大幅下降，成像分辨率也急劇惡化。因此，如何解決像差問題，實現，例如小鼠大腦皮層，深層區域的高質量成像成為光學成像發展中相當有挑戰性的問題之一。微型雙光子顯微鏡的優勢是。國內激光雙光子顯微鏡的原理

成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調焦設備。美國激光熒光雙光子顯微鏡光損傷

要想讓激發激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優化與標本改造。關于裝置優化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解，讓標本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達到最大值所持續的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達到80至100兆赫，這樣即能達到雙光子激發的高光子密度要求，又能不損傷細胞，使掃描能更好地進行。美國激光熒光雙光子顯微鏡光損傷