光學顯微鏡從1590年發明以來，不斷發展，促進生命科學日新月異的發現，幫助人類逐層打開生命本質的大門。同時，生命科學的發展不斷給光學顯微鏡提出新的要求，促使成像理論和技術持續更新迭代。科學進入21世紀，人們已經不滿足于在體外研究細胞和組織，需要能夠更真實地探索生命，在體內實時觀察細胞的發生和變化。此時，雙光子顯微鏡進入了科學家的視野。在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的（圖1）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發時，在波長為350nm光的激發下發出450nm熒光；而在雙光子激發時，可采用700nm的激發光得到450nm熒光。雙光子顯微鏡在多個領域研究中已有許多成功實例。國內激光熒光雙光子顯微鏡供應商

雙光子顯微成像技術不是什么新技術，早在20多年前就有了，目前已經在生命科學和材料科學中廣泛應用。幾年前雙光子過期后，已經推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上。即便如此，世界上很多實驗室都搭雙光子，自己搭的好處有很多，首先是便宜，尤其是實驗室已經有飛秒激光器，那就更很省錢了。其次是靈活，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動也靈活。好處就是可以鍛煉隊伍，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護也更加自由。當然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時候，開始要想方案，后來要解決各種實際問題。其次是花時間，加上買配件的時間，比買一臺現成的商業化雙光子耗時長。現在已經有不少關于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol，大多是老外寫的，中文的較少。其實完全自己搭一套好用的系統還是不容易的，尤其是沒有經驗的時候，容易走彎路，多花錢，也多花時間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買，在國內買這些東西耗時較長。因此，我想總結一下我們的經驗，貼出來分享，希望能幫到想自己動手的實驗室，國內熒光激光雙光子顯微鏡授權商由于其非侵入性和高分辨率的特點，雙光子顯微鏡成為了研究神經科學、ai癥研究、免疫學等領域的重要工具。

雙光子的來源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎獲得者MariaGoeppertMayer提出，并在30年后因為激光而得到實驗驗證，但WinfriedDenk用了近30年才發明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要理解非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生的非線性過程，需要極高的電場強度，電場取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小，脈沖寬度越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只有激光脈沖寬度。基于以上分析，能夠輸出高重復率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光已經成為雙光子顯微鏡的標準激發光源。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優勢:雙光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光強較低，無法激發，所以雙光子成像更清晰。

雙光子顯微鏡的優勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發熒光。下面是兩種技術的對比圖。雙光子激發熒光的主要優勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對神經細胞的形態結構、離子濃度、細胞運動、進行直接成像監測。

目前，世界各國的腦科學研究如火如荼，中國的腦計劃也即將啟動。其中，關于全景式解析腦連接圖譜和功能動態圖譜的研究成為重點研究方向，而如何打破尺度壁壘，融合微觀神經元和神經突觸活動與大腦整體的信息處理和個體行為信息，是領域內亟待解決的一個關鍵挑戰。2021年1月6日，由北京大學分子醫學研究所牽頭，聯合北大信息科學技術學院電子學系、工學院以及中國人民******醫學科學院等組成的跨學科團隊，在NatureMethods在線發表題為“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章。文中報道了第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0，其成像視野是該團隊于2017年發布的低1代微型化顯微鏡的7.8倍，同時具備三維成像能力，獲取了小鼠在自由運動行為中大腦三維區域內上千個神經元清晰穩定的動態功能圖像，并且實現了針對同一批神經元長達一個月的追蹤記錄。雙光子顯微鏡已延伸到各個領域研究中，它能對樣品進行三維觀察。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡光子探測

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雙光子顯微鏡為什么穿透能力強？生物組織在近紅外波段存在兩個窗口,第1個近紅外窗口對應波長在700nm-900nm,第2個近紅外窗口對應波長在1000nm-1400nm之間。舉例說明就是單晶硅對于可見光幾乎是不透明的，但是對于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了。原因有兩點：1.生物組織對紅外光的吸收弱，對可見光吸收強。類似的，平時用手電筒照射手指，會看到手通透紅亮，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少。2.生物組織對紅外光的散射弱。因為瑞利散射的強度反比于波長λ的四次方。類似的，早晨的太陽非常紅，也就是因為長波長的紅光穿透力更強。這兩點共同導致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強。國內激光熒光雙光子顯微鏡供應商