對于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數量級的脈沖能量才能獲得與2P激發的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結構性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內收集足夠的信號。復雜的行為通常涉及到大型的大腦神經網絡，該網絡既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經元活動與行為聯系起來，需要同時監控非常龐大且分布普遍的神經元的活動，大腦中的神經網絡會在幾十毫秒內處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經元動力學，就需要MPM具備對神經元進行快速成像的能力。快速MPM方法可分為單束掃描技術和多束掃描技術。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術通常也被統稱為多光子顯微鏡。美國bruker多光子顯微鏡系統

首代小型化雙光子顯微鏡在國際上獲得小鼠自由行為過程中大腦神經元和突觸的動態圖像后，我們成功研制了第二代小型化雙光子顯微鏡。它具有更大的成像視野和三維成像能力，可以清晰穩定地對自由活動小鼠三維腦區的數千個神經元進行成像，實現對同一批神經元的一個月追蹤記錄。通過對微光學系統的重新設計系統的。微物鏡工作距離延長至1mm，實現無創成像。內嵌可拆卸的快速軸向掃描模塊，可采集深度180微米的3D體成像和多平面快速切換的實時成像。該掃描模塊由一個快速的電動變焦透鏡和一對中繼透鏡組成，在不同深度成像時可保持放大倍率恒定。其變焦模塊重量，研究人員可根據實驗需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探頭可整體即時拔插，極大地簡化了實驗操作，避免了長周期實驗時對動物的干擾。在重復裝卸探頭同一批神經元時，視場旋轉角小于，邊界偏差小于35微米。美國bruker多光子顯微鏡系統目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等。

與傳統的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學切片和深層成像等功能，這兩個優勢極大地促進了研究者們對于完整大腦深處神經的了解與認識。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經元成像、大量神經元成像、高速神經元成像這三個方面論述了相關的MPM技術[1]。想要將神經元活動與復雜行為聯系起來，通常需要對大腦皮質深層的神經元進行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發和發射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強度來解決散射問題，但這會帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發光。

多光子激發掃描顯微成像系統的不足。只能對熒光成像。如果樣品包括能夠吸收激發光的色團，如色素，樣品可能受到熱損傷。分辨率略有降低，雖然可以通過同時利用共焦的小孔得到改善，但是信號會有損耗。受昂貴的超快激光器限制，多光子掃描顯微鏡的成本較高。多光子激發顯微鏡應用舉例。動物和腦片神經細胞結構與功能、動物腦皮層的成像、胚胎發育過程的長時間動態觀測、多光子激發光解籠、細胞內微區鈣動力學、多光子激發自發熒光、其它應用。雙光子共聚焦顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡具有更亮的橫向分辨率和縱向分辨率。

當激光光束焦點的位置在鏡面上，此時被反射的激光在無限空間中成為準直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一個激光光斑。同理，如果橫向掃描光束，則會形成遠離傾斜鏡鏡面的焦點，這又導致返回的光束會聚或發散，進而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點，通過這種方式即能實現連續的軸向掃描。對于較小的傾斜角，聚焦沒有球差。該組在實驗中表征了這種將橫向掃描轉換為軸向掃描技術的光學性能，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個數量級，從而可以在三個維度上量化快速的囊泡動力學。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12kHz進行共振遠程聚焦，該技術可對大腦組織和斑馬魚心臟動力學進行快速成像，并具有衍射極限的分辨率。多光子顯微鏡，為疾病診斷和藥物研發提供強大支持。全自動多光子顯微鏡成像深度

多光子顯微鏡，提高醫學病理診斷的準確性和效率。美國bruker多光子顯微鏡系統

多光子顯微鏡對成像深度的改善利用紅光或紅外光激發，光散射小（小粒子的散射與波長的四次方的成反比）。不需要***，能更多收集來自成像截面的散射光子。***不能區分由離焦區域或焦點區發射出的散射光子，多光子在深層成像信噪比好。單光子激發所用的紫外或可見光在光束到達焦平面之前易被樣品吸收而衰減，不易對深層激發。多光子熒光成像的特點。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對厚散射物質成像。信噪比∶多光子吸收采用的波長是單光子吸收的2倍以上，所以顯微試樣中的瑞利散射更小，熒光測定的信噪比更高。觀察活細胞∶離子測量（i.e.Ca2+），GFP，發育生物學等—減少了光毒性和光漂白，能對細胞長時間觀察。美國bruker多光子顯微鏡系統