新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統的成功研制是國家重大科研儀器研制專項的一個碩果。它彰顯了北京大學在生物醫學成像領域先期布局的前瞻性,鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學科交叉背景和重要技術創新能力的“中國智造”隊伍。目前,該研發團隊正在領銜建設“多模態跨尺度生物醫學成像”十三五國家重大科技基礎設施,積極參與即將啟動的中國腦科學計劃。可以期待,微型化雙光子熒光顯微成像系統將為實現“分析腦、理解腦、模仿腦”的戰略目標發揮不可或缺的重要作用雙光子顯微鏡是結合了雙光子激發技術和激光掃描共聚顯微鏡。激光雙光子顯微鏡分辨率
首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當紅的顯微成像技術。激光掃描共聚焦顯微技術,是熒光顯微成像的一種,用于激發樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中,樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發光照射,縱然焦平面外也有激發光照射,但通過探測器前的(pinhole),有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說,每個時刻,只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式,一個個點的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡(包括多光子顯微鏡)同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是,其采用的激發光波長較長,只有當兩個(或更多)激發光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點,出才會激發出熒光。也就是說,雙光子顯微鏡中,同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測,并且連焦平面外的熒光信號也不會有。美國bruker雙光子顯微鏡熒光探測雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。
和很多偉大的科學發明一樣,雙光子顯微鏡的出現也有一點偶然,但正是那瞬間的靈感為生物科學尤其是神經科學帶來了一種**性的成像技術:雙光子激發熒光顯微鏡。1990年初,當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業準備前往瑞士讀博后時,他看了一本關于激光掃描顯微鏡的書,從中了解到非線性光學效應——強光和物質的相互作用。當時,Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件,于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,換言之,與其通過一個紫外光子激發標記的鈣離子,通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器,Denk聯合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建,采集數據則用了兩到三天,于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。
雙光子技術在醫學診斷方面有著巨大的應用潛力。這方面沒有標準和體系,需要系統的醫學研究和龐大的醫學數據支撐。通過基于多光子成像技術研究細胞結構、生化成分、微環境、組織形態、代謝功能的影響信息,可以發現與細胞學、分子生物學、組織病理學、疾病的診斷和特征的關系。共同探索生理病理基礎和分子細胞生物學機制,篩選皮膚病、自身免疫性疾病等疑難疾病的識別、診斷和鑒別診斷依據,建立全新完整的多光子細胞診斷數據庫,明確不同疾病的多光子臨床檢測設備產品標準。在討論環節,來自病理科、呼吸中心、心內科、神經內科、皮膚科、研究所的多位醫生和科研人員結合各自的工作領域,與王愛民副教授進行了熱烈的討論。其中,毛發中心楊頂權主任擬再次邀請王愛民副教授進行學術交流。通過此次學術交流,病理學系和研究所分別與王愛民副教授課題組達成了初步合作意向。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像。
從雙光子到三光子:科學家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡。1996年,ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發明了三光子顯微鏡,如果雙光子吸收可行,那么三光子看起來也是自然的發展方向。三光子成像使用更長的波長,大約在1.3和1.7微米,其成像深度也比雙光子更深,目前記錄約為2.2毫米,人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡,三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖,而傳統的鈦寶石激光器難以達到這些要求,但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡觀察到的現象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發的鈉離子作用電勢。國外熒光激光雙光子顯微鏡授權商
雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收,而焦平面之外由于光強低無法被發動,所以雙光子成像更清晰。激光雙光子顯微鏡分辨率
雙光子顯微鏡(2PM)可以對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進行亞細胞分辨率的成像,從而測量不透明腦深部的活動。成像膜的電壓變化可以直接反映神經元的活動,但神經元活動的速度對于常規的2PM來說太快了。目前,電壓成像主要由寬視場顯微鏡實現,但其空間分辨率較差,且只能在淺深度成像。因此,為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化,需要將成像速率提高2PM。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發出的光,這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時間延遲的聚焦陣列。然后,該模塊被集成到一個帶有高速數據采集系統的標準雙光子熒光顯微鏡中,如圖2所示。光源是重復頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產生80個脈沖焦點,脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像。虛光源越遠,物鏡處的光束尺寸越大,焦點越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡,從而在X軸上產生0.82m和0.35m的橫向分辨率。激光雙光子顯微鏡分辨率
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