共聚焦顯微可以呈現這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優缺點，何況一臺儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內的的樣品，對于厚的或者樣品不能進拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅；3. 由于光照射的區域幾乎能通過這個Z軸的層面，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發，對于一些特殊激發波長的實驗，效率非常低。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達到 80至100兆赫茲。雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對神經細胞的形態結構、離子濃度、細胞運動、進行直接成像監測。國內激光雙光子顯微鏡廠家

雙光子顯微鏡是結合了雙光子激發技術和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的：首先，讓我們來看看什么是熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，照射被檢物體上的熒光物質或是熒光染料，使其發出熒光。相比普通光學顯微鏡，熒光顯微鏡運用了波長更短的紫外線，再將可見光過濾掉，提高了分辨力率。而當被檢物體過厚時，從不同深度發出的熒光都會打在物鏡上，使觀察到的像模糊、發虛，無法清楚的知道被檢物體的結構。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎上，增加了激光掃描裝置，從而解決了上述問題。激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經照明孔，經由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描。組織樣品中的熒光物質受到刺激后發出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測孔時先聚焦，然后被光探頭收集，轉化為信號輸送到計算機進行處理。這個裝置能讓通過探測***的只有焦平面上發出的熒光，使成像更為清晰準確，同時通過改變物鏡的焦距，能對不同焦平面進行掃描，通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像。進口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡原理顯微成像技術包含：雙光子顯微鏡、寬場熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、全內反射熒光顯微鏡等多種成像方式。

王愛民副教授結合工作實例，展示了雙光子顯微鏡的研發與應用。歷經3年多的協同奮戰，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，重量只為2.2克，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經元和神經突觸活動清晰、穩定的圖像，該顯微鏡適于佩戴在小動物頭部，可實時記錄數十個神經元、上千個神經突觸的動態信號，在大型動物上，還可望實現多探頭佩戴、多顱窗不同腦區的長時程觀測。雙光子顯微成像的在生物醫學研究和醫療領域應用有較大的應用前景，首先雙光子顯微鏡能夠進行細胞和組織結構成像，在亞微米級成像，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似；雙光子顯微成像能夠實時、在體、原位、無創地，根據不同物質組份的光譜特性，區分成像；雙光子顯微鏡能夠進行生化指標成像，在無造影劑的前提下，利用自發熒光、二次諧波、熒光獲得活細胞生化信息。

單光子顯微技術是成熟的熒光顯微技術，但由于其使用的激發光波長較短，成像深度有限；能量較大,會造成對熒光物質的漂白,光毒性嚴重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實現樣本三維成像要逐點掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時間活細胞成像。而寬場顯微鏡能夠很好地實現實時動態成像,光漂白小,因而較早應用于活細胞內的實時檢測，但寬場顯微鏡由于離焦信號的干擾,難以實現多維成像。雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。雙光子顯微成像技術是近些年發展起來的結合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發技術的一種新型非線性光學成像方法,采用長波激發，能對組織進行深層次成像。常用的比較好激發波長大多位于800-900nm，而水、血液和固有組織發色團對這個波段的光吸收率低，此外散射的激發光子不能激發樣品，因此背景第，光損傷小，適用于在體檢測。雙光子熒光成像技術能準確定位細胞內置入的微電極位置，從而觀察胞體、樹突甚至單個樹突棘的活性。研究者可完整的觀察神經組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經細胞單個樹突棘中的鈣分布。雙光子顯微鏡廠家就找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司；

激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經照明，經由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描。組織樣品中的熒光物質受到刺激后發出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測時先聚焦，然后被光探頭收集，轉化為信號輸送到計算機進行處理。這個裝置能讓通過探測的只有焦平面上發出的熒光，使成像更為清晰準確，同時通過改變物鏡的焦距，能對不同焦平面進行掃描，通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像。而配合了雙光子激發技術，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發揮功效。那么，什么是雙光子激發技術呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發技術。雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細胞進行特定實驗；ultima2PPLUS雙光子顯微鏡廠家電話

這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。國內激光雙光子顯微鏡廠家

配合雙光子激發技術，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發揮功效。那么，什么是雙光子激發技術呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發生雙光子激發，產生熒光，該點產生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達到逐點掃描的效果。國內激光雙光子顯微鏡廠家

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