Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經元成像，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經元的感官刺激誘導樹突鈣離子動態后，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是，霍華德·休斯醫學院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡，其成像視場達到5毫米，能夠跨多個腦區進行高速功能成像。根據清華大學單一采購來源的**指導意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍。30年來，雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術通常也被統稱為多光子顯微鏡。下圖統計了自1990年以來每年發表的多光子顯微鏡文章數量，發展速度可見一斑。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細孔，提高了熒光檢測效率。國內雙光子顯微鏡光子躍遷

美國霍華德·休斯醫學研究所在Janelia Farm ResearchCampus的吉娜博士小組與來自中科院上海光機所強場激光物理國家重點實驗室的王琛博士較近成功將一種新的自適應光學的方法和雙光子顯微鏡結合，研制出一種新的自適應光學雙光子熒光顯微鏡。通過校正小鼠大腦的像差，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數倍的成像分辨率和信號強度，明顯改進了成像質量，使得原來在鼠腦中不可見或者模糊的細節變得清晰可見，她們成功將該方法應用于老鼠視覺皮層第五層（約500μm）的形貌結構成像和鈣離子功能成像。這一新的自適應光學方法，使得在小鼠深層區域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現實。這一成果發表在較新一期的《Nature Methods》。美國bruker雙光子顯微鏡供應商聯系方式雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、有生命體的觀察！

細胞內鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當個細胞興奮時，產生了一個電沖動，此時，細胞外的鈣離子流入該細胞內，促使該細胞分泌神經遞質，神經遞質與相鄰的下一級神經細胞膜上的蛋白分子結合，促使這一級神經細胞產生新的電沖動。以此類推，神經信號便一級一級地傳遞下去，從而構成復雜的信號體系，終形成學習、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經系統中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態下大部分神經元細胞內鈣離子濃度約為50-100nM，而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經遞質的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學活性，而細胞質內鈣離子濃度由鈣離子的內外流平衡所決定，同時也受鈣結合蛋白的影響。細胞外鈣離子內流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現出來，以反映神經元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關的腦細胞。

FHIRM-TPM 2.0擴大了微型雙光子顯微鏡的適用性和實用性，使神經科學家能夠更自由地探索更多新的行為范式，包括身體運動、長時程的復雜過程，如學習和記憶，社會互動和恐懼條件反射，甚至是慢性疾病的進展和老化，如神經發生和再生，疾病進展和衰老，以破譯大腦的奧秘。在一批“早鳥項目”中，該系統已被多個研究組應用于不同的模式動物和行為范式，如小鼠的社交新穎性識別、斑胸草雀受***調控后大腦特定神經元變化、新型神經遞質乙酰膽堿探針的傳導適應性分析以及獼猴三腦區成像等多項研究。依托兩代微型化雙光子成像技術，該團隊還在南京市江北新區建立了規模化高通量腦功能成像的南京腦觀象臺（Nanjing Brian Observatory），于2020年12月10日舉辦了落成典禮。通過與世界范圍內的神經科學家進行廣合作，腦觀象臺現正在服務三十多個科研項目，成為開展大型腦科學問題研究的重要科研服務平臺。雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當中；

共聚焦顯微可以呈現這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優缺點，何況一臺儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內的的樣品，對于厚的或者樣品不能進拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅；3. 由于光照射的區域幾乎能通過這個Z軸的層面，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發，對于一些特殊激發波長的實驗，效率非常低。雙光子顯微鏡除了可以進行厚的組織樣品拍攝以外呢，可以在小鼠的的任何部位進行成像。美國激光雙光子顯微鏡熒光壽命計數

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雙光子顯微鏡的應用由于適合動態成像，雙光子顯微鏡一經問世便很快應用于神經科學、遺傳發育、藥物代謝等領域。雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對***神經細胞的形態結構、離子濃度、細胞運動、分子相互作用等進行直接成像監測，而且能夠進行光裂解、光轉染和光損傷等光學操縱。同時，雙光子顯微鏡能動態監測**在體內的生長和轉移，并可對**治療過程中*細胞的變化進行實時觀測和評估。隨著光學技術、熒光探針技術、計算機成像技術的發展，雙光子顯微技術會得到更大提升和更廣的應用，未來不僅用于基礎研究，也將擴展到臨床應用。國內雙光子顯微鏡光子躍遷