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來源: 發(fā)布時(shí)間:2021-11-14

    血友病是一組**為常見的遺傳性凝血障礙,根據(jù)因子缺陷的不同分為甲、乙兩型,(Ⅷ、Ⅸ因子缺陷),也有復(fù)合型血友病,但不常見。甲型血友病發(fā)病率為1/10000,Ⅷ因子基因位于G6PD基因附近,全長(zhǎng)186Kb,大范圍的基因重排(缺失、插入、重復(fù))導(dǎo)致甲型血友病的病例很少,*為Ⅷ因子缺陷的5%,大部分病人表現(xiàn)為單個(gè)或少數(shù)堿基的突變。由于Ⅷ因子基因長(zhǎng)度為186Kb,突變位點(diǎn)多,而且新生突變頻率高,從臨床角度講不能對(duì)每一個(gè)突變都檢測(cè),可對(duì)**為常見的幾種突變類型進(jìn)行檢測(cè),主要的檢測(cè)手段是PCR結(jié)合RELP分析。乙型血友病發(fā)病率占血友病的20%,其基因變化及檢測(cè)方法與甲型血友病類似。區(qū)別雄性及雌性的物質(zhì)基礎(chǔ)是性染色體,哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育中,雌性表型不需要任何調(diào)節(jié),而雄性表型則由多因素決定,位于Y染色體上的指導(dǎo)雄性性別分ss化的基因命名為睪丸決定因子(TDF)。現(xiàn)代研究表明,SRY(Sex-determiningregionofYchromosome)基因是TDF基因,位于Y染以體短臂末端。SRY區(qū)缺失易導(dǎo)致46XY核型個(gè)體發(fā)育成女性。進(jìn)行基因檢測(cè)可以檢出SRY基因組的易位及缺失,從而診斷性別發(fā)育異常,這一探索性別異常的研究非常熱門。另外還有一種46XY核型異常的病人即睪丸女性化,這是用于雄***受體。 由于PCR簡(jiǎn)便易行、靈敏度高等有點(diǎn),該技術(shù)被應(yīng)用于多數(shù)分子實(shí)驗(yàn)的研究中。國(guó)產(chǎn)梯度PCR儀銷售電話

    基本的PCR須具備:1.要被復(fù)制的DNA模板2.界定復(fù)制范圍兩端的引物(四種脫氧核苷酸)及水。利用升溫使DNA變性,在聚合酶的作用下使單鏈復(fù)制成雙鏈,進(jìn)而達(dá)到基因復(fù)制的目的。PCR的設(shè)想核酸研究已有100多年的歷史,二十世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù),Korana于1971年提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想:“經(jīng)過DNA變性,與合適的引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。Mullis使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段,其缺點(diǎn)是:①Klenow酶不耐高溫,90℃會(huì)變性失活,每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行,容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配,其PCR產(chǎn)物特異性較差,合成的DN段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn),但由于Klenow酶不耐熱,在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí),會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化,每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期,給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。 高校科研實(shí)驗(yàn)室國(guó)產(chǎn)PCR儀銷售電話在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)中,pcr儀對(duì)傳染疾病的診斷意義尤為重要。

    引物設(shè)計(jì)時(shí)使合成的寡核苷酸鏈(18~24聚物)適用于多種實(shí)驗(yàn)條件仍不失為明智之舉。②引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會(huì)影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對(duì)于引物的3’末端形成的二聚體,應(yīng)控制其ΔG大于,因?yàn)榇朔N情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性,引物中間或5’端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu),也以3’端或近3’端對(duì)引物-模板結(jié)合影響更大;影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對(duì)的鍵能之外,與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3’末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。③引物GC含量和Tm值PCR引物應(yīng)該保持合理的GC含量。含有50%的G+C的20個(gè)堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56~62℃范圍內(nèi),這可為有效退火提供足夠熱度。一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。協(xié)調(diào)性差的引物對(duì)的效率和特異性都較差,因?yàn)榻档土薚m值導(dǎo)致特異性的喪失。這種情況下引物Tm值越高,其錯(cuò)誤引發(fā)的機(jī)率也越大。若采用太高的退火溫度,Tm值低的引物對(duì)可能完全不發(fā)揮作用。在從一批在特定序列范圍內(nèi)已合成好的寡核苷酸中選擇一對(duì)新的引物時(shí),這種GC含量和Tm值的協(xié)調(diào)非常關(guān)鍵。一般來說。

    基因?qū)嶒?yàn)室與PCR實(shí)驗(yàn)室的規(guī)劃布局要求:1、環(huán)境要求通風(fēng)、溫度和濕度實(shí)驗(yàn)室的長(zhǎng)期使用,有毒、有害等污濁氣體不及時(shí)排出會(huì)危害室內(nèi)操作人員健康。實(shí)驗(yàn)室良好的通風(fēng)環(huán)境是必要前提。除了實(shí)驗(yàn)室建筑選址的朝向和所處地域的氣候特征,實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)系統(tǒng)也是必須考慮的問題。通風(fēng)柜作為保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)安全、衛(wèi)生的重要柜體,是建立一個(gè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室必不可少的組成部分。潔凈度實(shí)驗(yàn)室的潔凈,除了實(shí)驗(yàn)室地面、實(shí)驗(yàn)室器具的清潔,還要考慮實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣的潔凈度。不良的空氣質(zhì)量會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行,擴(kuò)散到空氣中的有害物質(zhì)也會(huì)危害到人體健康。2、設(shè)施要求給排水、排污系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的實(shí)驗(yàn)室,都會(huì)配置有供水、排水和排污系統(tǒng),實(shí)驗(yàn)臺(tái)配置水池、滴水架、排水槽,通風(fēng)柜與通風(fēng)柜管道聯(lián)通。3、實(shí)驗(yàn)室工作人員要求PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作人員必須參加由國(guó)家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗(yàn)中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增培訓(xùn)班,并持證上崗。PCR實(shí)驗(yàn)室通過驗(yàn)收,實(shí)驗(yàn)室至少必須應(yīng)有兩個(gè)以上持有“臨床基因檢測(cè)上崗證”。PCR實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序(SOP)、建立系列質(zhì)量管理文件等,確保實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行符合國(guó)家衛(wèi)生部的要求,確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、確保實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生安全。熒光定量PCR因操作方便、運(yùn)行速度快、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確,受到越來越多的分子生物學(xué)研究者青睞。

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PCR擴(kuò)增過程中,熒光定量PCR儀通過熒光信號(hào),對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。國(guó)產(chǎn)梯度PCR儀銷售電話

原位PCR儀:用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀稱作原位PCR儀。如病源基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等。是保持細(xì)胞或組織的完整性,使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中,在細(xì)胞的靶DNA所在位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增。不但可以檢測(cè)到靶DNA,又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置,對(duì)于在分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有重大的實(shí)用價(jià)值。主要應(yīng)用于臨床、科研。原位PCR儀,主要應(yīng)用于:檢測(cè)外源性基因片段,提高檢出率,集中在病毒的檢查上,如HIV、HPV、HBV、CMV等;觀察病原體在體內(nèi)分布規(guī)律;內(nèi)源性基因片段,如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRN段、基因片段等;檢測(cè)導(dǎo)入基因;遺傳病基因檢測(cè)如β-地中海貧血。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀:在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加一個(gè)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)的PCR儀稱作熒光定量PCR儀。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR儀擴(kuò)增原理相同,只是PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記,使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。把這種PCR儀叫做實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。國(guó)產(chǎn)梯度PCR儀銷售電話

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