實時熒光定量pcr儀,由熒光定量系統(tǒng)和計算機組成,用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實時設(shè)備相連的計算機收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實時設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。正常化后可以設(shè)定域值水平,這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。實時熒光定量pcr儀組成熒光定量系統(tǒng)和計算機作用,監(jiān)測循環(huán)過程的熒光,數(shù)據(jù)形式顯示,通過開發(fā)的實時分析,軟件以圖表的表現(xiàn)。實時熒光定量pcr儀優(yōu)勢:樣品到達域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值(限制點的循環(huán)數(shù))。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴增效率為大,這樣可以獲得準確,可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時擴增的還有標有相應(yīng)濃度的標準品,線性回歸分析將產(chǎn)生一條標準曲線,可以用來計算未知樣品的濃度。實時熒光定量pcr儀技術(shù)原理:所謂real-timeQ-PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中,兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用:(1)在90年代早期,TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)。 PCR擴增儀又稱為PCR基因擴增儀、PCR核酸擴增儀、聚合酶鏈反應(yīng)核酸擴增儀。上海力康高校科研PCR儀價格便宜
PCR儀的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:1、模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準備;2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;3、引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍(Plateau)。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。在此同時認識到蛋白質(zhì)是接受RNA的遺傳信息而合成的。50年代Zamecnik等在形態(tài)學(xué)和分離的亞細胞組分實驗中已發(fā)現(xiàn)微粒體(microsome)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的部位。 上海高校科研PCR儀銷售廠家PCR儀是為了解決在體外特異性地擴增某個基因的問題,從而滿足對核酸的體外研究和應(yīng)用。
實驗室基礎(chǔ)設(shè)施設(shè)計:包括實驗室基礎(chǔ)裝修、實驗室凈化工程、實驗室供排水工程、實驗室電路系統(tǒng)。1)實驗室基礎(chǔ)裝修需要潔凈天花、地板、隔斷,合理設(shè)置緩存間及配置凈化門、觀察窗、傳遞窗等。2)實驗室凈化工程實驗室應(yīng)配備單獨送排風(fēng)設(shè)施,試劑配置區(qū)、核酸提取區(qū)和擴增分析區(qū)應(yīng)配備凈化系統(tǒng)。3)實驗室供排水工程包括非手動水龍頭、不銹鋼或PP水池和緊急淋浴器及供排水管線管路。4)實驗室電路系統(tǒng):根據(jù)儀器的功率配置合適的功率,特別注意高壓滅菌鍋的功率,注意實驗室用電安全。5)配備適用的應(yīng)急器材,如應(yīng)急照明設(shè)備、消防器材、意外事故處理器材等。實驗室儀器及設(shè)備:1)更衣室儀器及設(shè)備:更衣柜或掛衣架、鞋柜以及消毒器和烘干器。2)配液室儀器及設(shè)備:佰倫超凈工作臺、冰箱、小型離心機、旋渦振蕩器、微量移液器等。3)樣品處理室儀器及設(shè)備:離心機、組織研磨機、Ⅱ級生物安全柜、恒溫水浴鍋、冰柜等、可移動紫外消毒器。4)核酸提取室儀器及設(shè)備:核酸提取儀、Ⅱ級生物安全柜、恒溫水浴鍋、小型離心機、微量移液器、可移動紫外消毒器等。5)擴增分析區(qū)儀器及設(shè)備:熒光定量PCR儀、電腦、打印機、不間斷電源、可移動紫外消毒器等。
PCR基因擴增法在遺傳性疾病產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用,遺傳病是由于遺傳物變化而引起的機體某一功能或缺陷或異常所致的疾病,其根本變化在于遺傳物質(zhì)。苯西酮尿癥(PKU)是一種常染色體隱性遺傳病,患者因苯丙酸羥化酶轉(zhuǎn)化為酷氨酸,使苯氨酸及其代謝物在體內(nèi)大量蓄積,出現(xiàn)腦組損傷及不可逆性智力發(fā)育障礙。PKU患者出生時正常,新生兒一經(jīng)確診為PKU停止母乳喂養(yǎng)采用低苯丙氨酸欽食療法8—10年,可使患者智力水平發(fā)展維持正常。由于低苯丙氨酸欽食非常昂貴,一般家庭難以承受,因此,施行產(chǎn)前診斷,防止患兒出生是比較好的選擇。PAH只在肝細胞中表達,不能用血細胞,成纖維細胞、羊水、絨毛細胞進行酶活性分析,只能進行基因診斷。PKU的基因變化并非全部PAH基因的缺失,而是以點突變?yōu)橹饕憩F(xiàn)形式,而且其突變位點很多。必須使用PCR擴增結(jié)合,ASO,SSCP或使用擴增片段長度多態(tài)性分析(AmpFLA)進行檢測,這些技術(shù)都較復(fù)雜,檢驗人員須經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)。 熒光定量PCR是近年發(fā)展起來的實時定量檢測特定核酸技術(shù),是核酸探針,熒光共振能量傳遞和PCR技術(shù)的有機結(jié)合.
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PCR擴增儀通常由熱蓋部件、熱循環(huán)部件、傳動部件、控制部件和電源部件等部分組成。上海力康高校科研PCR儀價格便宜
原位PCR儀:用于從細胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細胞內(nèi)基因擴增儀稱作原位PCR儀。如病源基因在細胞的位置或目的基因在細胞內(nèi)的作用位置等。是保持細胞或組織的完整性,使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細胞中,在細胞的靶DNA所在位置上進行基因擴增。不但可以檢測到靶DNA,又能標出靶序列在細胞內(nèi)的位置,對于在分子和細胞水平上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有重大的實用價值。主要應(yīng)用于臨床、科研。原位PCR儀,主要應(yīng)用于:檢測外源性基因片段,提高檢出率,集中在病毒的檢查上,如HIV、HPV、HBV、CMV等;觀察病原體在體內(nèi)分布規(guī)律;內(nèi)源性基因片段,如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRN段、基因片段等;檢測導(dǎo)入基因;遺傳病基因檢測如β-地中海貧血。實時熒光定量PCR儀:在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)的PCR儀稱作熒光定量PCR儀。其PCR擴增原理和普通PCR儀擴增原理相同,只是PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記,使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)得出量化的實時結(jié)果輸出。把這種PCR儀叫做實時熒光定量PCR儀。上海力康高校科研PCR儀價格便宜
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